中科赛洱生物科技（黑龙江）有限公司

1. “Missing-self”机制？

NK细胞通过自身表面的激活型和抑制型受体，调节自身的细胞毒性。抑制型受体识别并结合MHC-I，杀伤那些没有表达MHC-I的细胞。而MHC-I在抗原呈递过程中，激活细胞毒性T细胞。但是，当细胞被感染或变异，MHC-I表达降低，使自身免于被T细胞发现。NK细胞可以在没有抗体或MHC的情况下，识别并快速响应。对于那些失去自身标记的MHC-I型细胞，NK细胞可以直接进行杀伤。

2. BTCKII NK试剂盒以K562细胞株为载体，在收获时会不会存在残留？

每批工程细胞都是经过定量的γ射线灭活，并进行了安全性、有效性测试。取D14天收获的NK细胞，通过STR方法检测BTCKII工程细胞残留，检测结果为无残留；“Missing-self”机制，D0在D4还能看到，D7（70%左右NK纯度）加进去的工程细胞D8天基本被清除。

3. 试剂盒制备可达到多少倍扩增？

BTCKII NK试剂盒第14天扩增可达10000倍左右，阳性率可达90%以上（计算方式：纯NK数量比较）。

4. 工程细胞在-80℃和液氮中可以储存多久？

-80℃半年有效期，液氮一年有效期。

5. 采集样本注意事项？

(1) 脐血采集：如果使用采血袋采集，建议使用200mL容量的采血袋（血液保存液III），建议弃14ml血液保存液。

(2) 外周血采集：无菌Heparin sodium抗凝真空采样管（10ml，推荐品牌：BD、非可替），禁止使用EDTA抗凝的真空采样管。

(3) 避免血液凝血，影响单个核收率；运输时，禁止样本接触冰袋，避免出现溶血。

6. 样本时限要求？

新鲜样本：要求采集到制备时间间隔6h内（尤其是脐带血），如超过24h则不建议进行NK培养。采集后2-8℃运输，外周血使用10mL无菌Heparin sodium采血管，采取外周血40mL，脐带血使用血液保护液III，采取脐带血至少80mL。

冻存样本：请确认使用冻存液类型以及该冻存方案是否能够完成复苏并进行NK细胞的培养，推荐使用我司通用型细胞冻存液（货号：FM-01）冻存单个核细胞。

7. 是什么原因导致样本出现凝血现象？

抗凝剂与血液样本没有混合均匀。

8. 我公司淋巴细胞无血清培养基的优势？

我公司无血清培养基与BTCKII NK细胞培养试剂盒适配良好，可以按照推荐操作步骤培养，价格相对较低。推荐其他公司无血清培养基：LONZA X VIVO15（货号：04-418Q）。

9. 培养基使用前，是否需要将培养基预热？

培养基使用前，可以将培养基放在室温回温，也可将使用的培养基放在37℃的水浴锅中预热，禁止将整瓶培养基反复预热。

10. IL-2推荐使用浓度和品牌？

我司NK制备推荐使用浓度为200IU/mL IL-2，品牌为北京双鹭。

11. 淋巴细胞分离液使用注意事项？

操作前将样本和淋巴细胞分离液复温。吸取过多的白膜层下方分离液会导致粒细胞数量增加，吸取过多的淋巴细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。

12. 脐血样本红细胞量较大，应怎样尽可能减少红细胞干扰？

(1) 淋巴细胞分离液和样本使用前恢复至室温（20℃）；

(2) 增加HES去除红细胞操作；

(3) 吸取白膜层时避吸到下方其它细胞。

13. 血浆灭活条件

56℃，20-30min（温度保持在56℃至少20min），灭活后2000g，10min去除沉淀。

14. 什么原因导致血浆颜色偏红？

可能在运输过程中，剧烈震荡、样本接触冰块或放置时间过长，导致红细胞破裂，产生溶血现象。

15. 制备中培养瓶和培养袋要求？

(1) 要求使用TC处理水平较高的贴壁细胞培养瓶。

(2) 推荐使用CORNING或TAKARA的细胞培养袋（可以咨询技术支持）。

(3) 大的细胞培养袋培养小体积的细胞悬液时，应将培养袋折叠，使用合适的底面积。

16. 在培养过程中，培养基呈现果冻状，什么原因导致？

血浆没有灭活或灭活不完全，血浆中的蛋白成分与培养基相互作用导致培养基呈果冻状。

17. 分离单个核细胞后，细胞数量过多或过少怎么办？

正常情况下，50ml样本可以分离一个亿以上单个核细胞，细胞数量过多可以考虑单个核细胞冻存，细胞过少应及时考虑单个核细胞分离实验细节，是否完全收集全部单个核细胞。

18. 样本接种密度和数量是多少？建议加大或减少接种密度么？

建议接种密度为2*10⁶个/ml，接种数量为4*10⁷个/瓶，D0体积一般为20ml培养基+1ml血浆；不建议加大或减少接种密度，否则可能导致试剂盒的工程细胞数不匹配，影响最终收获细胞数量或者阳性率。

19. 工程细胞复苏过程？

BTCKII-1ml：取BTCKII-1ml工程细胞，38℃水浴，浮漂解冻1分45秒(理想状态为取出时管内刚好还有一小块冰)，加入含有9ml预冷的复苏洗涤液的离心管中，离心（500g，3min，快升快降）弃上清，使用培养基重悬工程细胞。

BTCKII-4ml：当细胞体积达到100-120ml时，取BTCKII-4ml工程细胞，38℃水浴，浮漂解冻2分40秒(理想状态为取出时管内刚好还有一小块冰)，解冻后加入9ml预冷的复苏洗涤液的离心管中，离心（500g，3min，快升快降）弃上清，使用培养基重悬工程细胞。

20. 工程细胞复苏前在-20暂存可不可以？

不可以，-20—-40℃左右容易重结晶。解冻前要维持-70℃以下。

21. BTCKII-1mL工程细胞接种后几天激活？

BTCKII-1mL加入后3~4天激活。

22. Day0天制备样本的离心参数？

梯度离心：样本铺到淋巴细胞分离液上，离心（外周血：500g，30min，慢升慢降；脐带血：700g，30min，慢升慢降）；第二次离心：将单个核细胞取出时加入生理盐水，此时离心管中有血浆、细胞、盐水，离心（400g，8min，快升快降）；第三次离心：此时对细胞进行洗涤离心（300g，8min，快升快降）。

23. 为什么Day0~3要静置培养？

主要原因：影响工程细胞和NK细胞之间的接触与信号传递，可能会延迟NK细胞激活时间。同时可能会导致培养体系损失水分影响渗透压/PH，从而影响NK细胞激活。

24. Day 7二轮刺激应注意什么?

1) 培养基呈橙黄或黄，体积不超过200ml，计数超过2*10⁶个/ml，进行二轮刺激操作。

2) 转袋操作：将瓶内细胞轻轻吹悬，加入培养袋，使用培养基清洗原培养瓶，将细胞尽量都转移至培养袋中；

25. Day14细胞收集培养袋中细胞密度一般在什么范围？

3.0-4.0*10⁶/mL，活率≥90%

26. NK细胞冻存密度？

1.0*10⁸个/ml左右；

27. 什么原因导致复苏单个核细胞活率低，回收率低？

在冻存或复苏过程中操作不规范，波动较大。复苏单个核细胞时，应选择15ml离心管，损耗会降低。